Ne nedir ? :

bilimist

bilimist Yazdı...



Polimeraz zincir tepkimesi nedir ?

27 Nisan 2015 Bu içerik 9.330 kez okundu.

Kısaca;

Floresan boyalar yardımıyla "gerçek zamanlı" olarak DNA'nın ayırt edilmesi ve DNA miktarının gösterilmesi tekniğidir.



Polimeraz zincir tepkimesi nedir ?


Polimeraz zincirleme tepkimesi (Polymerase Chain Reaction - PCR), DNA içerisinde yer alan, dizisi bilinen iki segment arasındaki özgün bir bölgeyienzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir.

Metot basitçe tüp içerisinde nükleik asitlerin uygun kosullarda çoğaltılması esasına dayanır. Bir çeşit "in vitro klonlama" olarak da tanımlanan PCR; 94 °C-98 °C aralığında gerçekleştirilen denatürasyon, 37 °C-65 °C aralığında gerçekleştirilen tavlama (İng. annealing) ve 72 °C’de gerçekleştirilen uzama aşamalarından oluşur ve bu döngülerin belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır.

PCR yönteminin gelişmesinde en büyük katkıyı Taq Polimeraz enziminin bulunması yapmıştır çünkü bu enzim yüksek sıcaklıklarda dahi dayanabilen tek enzimdir. Bu enzim ilk olarak Yellowstone milli parkında bir kaplıcada yaşayan termofilik bir bakteriden izole edilmiştir.Dr. Kary B. Mullis 1980’li yıllarda yaptığı PCR çalışmaları ile 1993 yılında Kimya alanında Nobel Ödülü almıştır.

PCR yaygın olarak tıbbi ve biyolojik araştırma laboratuvarlarında kalıtsal hastalıkların teşhisi, genetik parmak izlerinin tanımlanması, bulaşıcı hastalıkların teşhisi, genlerin klonlanması, babalık testi ve DNA hesaplaması gibi değişik konularda yaygın bir şekilde kullanılmaktadır.

PCR yöntemine dayalı olarak birçok primer olarak adlandırılan başlatıcı DNA teknikleri geliştirilmiştir. bu başlatıcı DNA'lar belli dizilere sahip ve sentetik olarak üretilebilen moleküllerdir. PCR'a dayalı RAPD, AFLP, SSR ve ISSR gibi markör teknikleri geliştirilmiştir. Bu teknikler birçok bitki ve hayvanda genetik akrabalığın teşhisinde türiçi ve türlerarasında kullanılmaktadır.

Kaynak: wiki

-------------------------

04. Polimeraz Zincir Reaksiyonunun (PZR) Modifikasyonları

Yukarıda açıklanan ve çok yararlanılan konvansiyonel polimeraz zincir reaksiyonunun bir çok modifikasyonları yapılmıştır. Bunlardan önemli bazılarının çok kısa olarak çalışma mekanizmaları aşağıda bildirilmiştir.

1) İnvers (tersine dönmüş) polimeraz zincir reaksiyonu

2) Asimetrik polimeraz zincir reaksiyonu

3) Homopolimerli polimeraz zincir reaksiyonu

4) İn situ polimeraz zincir reaksiyonu

5) Hot start polimeraz zincir reaksiyonu

6) Multipleks polimeraz zincir reaksiyonu

7) Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu

8) Nested polimeraz zincir reaksiyonu

9) RNA’nın amplifikasyonu

04.01. İnvers (tersine dönmüş) Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Bu teknik, bilinen sekanslara bitişik olarak bulunan ve fakat bilinmeyen bazlara sahip olan DNA segmentlerini amplifiye etmede kullanılır. Bilinmeyen sekanslar, tersine çevrilerek içe alındığı için bu adla tanımlanmaktadır.



İnvers PZR yukarıdaki şekilde gösterilmektedir.

1) Bilinen sekansın iki ucunda bulunan ve baz sıraları bilinmeyen segmentler belli bir uzaklıktan restriksiyon endonukleaz ile kesilir ve iki tarafta yapışkan uçlar meydana getirilir.

2) Bu kesim sonucunda molekül lineer bir forma gelir.

3) İki yapışkan uç birleştirilerek molekül sirküler şekle dönüştürülür.

4) Ortada bulunan ve bilinen sekanslara sahip olan DNA segmenti, ortasından başka bir restriksiyon endonukleaz ile bölünerek molekül tekrar lineer bir forma getirilir. Bu molekülün iki ucunda bilinen sekanslar bulunmaktadır.

5) Bu iki uçta bulunan bilinen sekanslara komplementer olan iki ayrı primer hazırlanarak reaksiyon ortamına katılır. Ayrıca, Taq polimeraz ve polimerizasyon için gerekli olan 4 tür dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) de ilave edilir.

6) Geri kalan işlem konvansiyonel PZR’daki prosedüre uyularak devam ettirilir. Böylece, bilinmeyen sekanslara cDNA sentezlenmiş ve bunların baz sıraları da belirlenmiş olur.

04.02. Asimetrik Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Hedef DNA’nın sadece bir iplikçiğinin amplifikasyonuna yönelik ve farklı oranda (1:50) primerler kullanılarak yapılan bir polimeraz zincir reaksiyonudur. Asimetrik PZR iki aşamada gerçekleştirilir. Reaksiyonda az sayıda olan primerler kullanıldıktan sonra, çok sayıda olan diğer primerler tek iplikçik DNA zincirinin sentezini başlatır ve çoğaltır.



Asimetrik PZR yukarıdaki şekilde gösterilmektedir.

04.03. Homopolimerli Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Bu reaksiyon, primer bağlanma bölgesi olarak yalnız bir sekansın bilindiği durumlarda uygulanmakladır. Bu bilinen bölgeye primerler bağlanırlar. Bu yöntemde, mRNA molekülü revers transkriptaz enzimi ile komplementer DNA (cDNA) haline dönüştürülür. Elde edilen tek iplik DNA molekülünün 3'-terminusuna poli G’ler bağlanır. Bu uçlara bağlanabilmesi için 5'-terminusunda poli C’ler bulunan primerler hazırlanır ve reaksiyona iştirak ettirilerek tek iplikçik cDNA’ya ikinci bir DNA sentezlenir. Sonra bu iki DNA ayrılarak her birine spesifik primerler kullanılarak amplifiye edilirler.

04.04. İn Situ Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Bu tekniğin esasını, morfolojik olarak sağlam hücre ve dokuların DNA’sının amplifikasyonu oluşturur. Bu yöntem, daha ziyade, parafinlenmiş veya arşiv dokuları için geliştirilmiştir. Bir lâm üzerinde tespit edilmiş ve morfolojik olarak sağlam hücre veya doku örnekleri hedef DNA (veya mRNA) kaynağı olarak kullanılır. Lâm üzerine, proteaz solüsyonu ilave edilerek dokulardaki proteinler giderilir ve %0.5 Nonidet P40’la da permeabilitesi artırılır. Sonra üzerine amplifikasyonda gerekli olan komponentler (primerler, 4 tür dNTP, MgCl, ve diğer solüsyonlar) konur ve üzerine bir lâmel kapatıldıktan sonra kenarları yapışkan bir madde (veya tırnak cilası) ile sabitleştirilir. Bu aşamadan sonra, lâm alüminyum bir kaba konarak Thermal cyclere yerleştirilir. Ortama 60°C’de Taq polimeraz ve mineral yağ ilave edilerek lâmel hemen kaldırılır. Sonraki işlemler, konvansiyonel PZR da olduğu gibidir.

Amplifiye olmuş ürünlerin spesifik olup olmadıklarını saptamada nonradioaklif maddelerle (biotin, digoxigenin, vs.) işaretli problardan yararlanılır.

04.05. Hot Start Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Konvansiyonel PZR yöntemlerinde kullanılan komponentler (hedef DNA, primerler, Taq polimeraz, MgCl2, dNTP, bufferler, vs.) oda ısısında ve birlikte tüplere konarak aynı anda reaksiyona sokulurlar. Ancak, bu tarzdaki uygulamada, primerler, reaksiyon başlamadan önce oda sıcaklığında Taq polimerazın etkisi altında, hedef DNA dışındaki bazı nonspesifik sekansları da amplifiye etmekte ve böylece yanlış pozitif reaksiyonlara yol açmaktadır. Bazı durumlarda da primer oligomerizasyonu, primer kaybı, nonspesifik amplifikasyonlar, vs. meydana gelebilmektedir. Bu olumsuz durumlara mâni olmak için geliştirilen Hot Start PZR’da reaksiyona giren maddelerin bir kısmı (primerler, dNTP, MgCl2, buffer) oda sıcaklığında tüplere konulmakta, sonra bunların üzerine buharlaşma ile madde kaybını önlemek için mineral yağ (manuel sistemde) veya balmumu tableti (otomatik sistemde) eklenmektedir. Geri kalan komponentler (Taq polimeraz, hedef DNA, buffer) de optimal ısı olan 60-80°C arasında reaksiyon tüpüne katılırlar. Bundan sonraki aşamalar konvansiyonel sistemdeki gibidir.

04.06. Multipleks Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Bu teknik, aynı amplifikasyon reaksiyonunda, farklı hedef DNA sekanslarına yönelik hazırlanan spesifik multiple primer çiftlerinin kullanılması ile gerçekleştirilir. Değişik hedef sekanslarının koamplifıkasyonu bir çok amaç için kullanılma olanağı bulunmaktadır. Şöyle ki,

a) DNA sekanslarının büyük bir bölümü, bunlarda bulunması muhtemel alterasyonlar yönünden incelenebilirler.

b) Hedef DNA’nın farklı segmentleri araştırılabilir,

c) Sekansların amplifiye olabilirliğinin internal kontrolleri yapılabilir

d) Bir numunede bulunan değişik ajanlara ait DNA’lar aynı tüpte aynı anda amplifiye edilebilirler.

Bu test, S. aureus ve C. difficile ’de denenmiştir.

04.07. Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Konvansiyonel PZR, genellikle, kalitatif bir karakter taşır. Diğer bir ifade ile amplifikasyon var veya yok sorusuna cevap verebilmektedir. Halbuki, son yıllarda geliştirilen yeni PZR teknikleri ile amplifiye olan hedef DNA’nın miktarı hakkında da bir bilgi verebilecek düzeye ulaşılmıştır. Bu yöntem, reaksiyona başlangıçta konulan hedef DNA miktarı ile, PZR sonunda saptanan ürünün düzeyi arasındaki lineer korelasyonun bulunup-bulunmadığını ortaya koymaktadır.

04.08. Nested Polimeraz Zincir Reaksiyonu

İki aşamalı olan bu testte, birinci periyodda, amplifikasyon tek primer çifti ile 15-30 kez tekrarlanır. Oluşan ve sayısal olarak artan ürünler, yeni bir reaksiyon tüpüne transfer edilerek burada, internal sekanslara spesifik sekonder primer çiftleri kullanılarak ikinci bir amplifikasyona tabi tutulur. Bu ikinci defa da 15-30 kez tekrarlanır ve oluşan ürünler jel elektroforezle ortaya konulurlar.

Bu yöntemin avantajları yanı sıra dezavantajları da (özellikle, transfer sırasında meydana gelen kontaminasyonlar, vs.) bulunmaktadır. Bu nedenle iki tüp yerine, tek tüp kullanmak suretiyle kontaminasyon riski minimal düzeye indirilmiştir. Bu tek tüp sisteminde, özellikle, iki tür reaksiyon ısısı kullanılmaktadır (düşük ve yüksek ısı).

[1] Kaynak: Temel Mikrobiyoloji

---------------------------

POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PCR)
Tüm dünyada canlıları oluşturan genetik yapının
çözülmesi, ortaya çıkarılan bu yapıdaki genlerin
yerlerinin saptanması, işlevlerinin anlaşılması, ilişkilerinin
belirlenmesi amacıyla yürütülen çalışmalar büyük bir hızla
devam etmektedir. Bu amaç doğrultusunda, belirlenen hedefe
ulaşmayı kolaylaştıracak, hızlandıracak yöntemlerin geliştirilmesi
zorunlu hale gelmiştir. Basit gibi görünmekle birlikte,
geliştirilen bu yöntemlerin en önemlilerinden birisi Polimeraz
Zincir Reaksiyonu ("Polymerase Chain Reaction", PCR)'dur.
1985 yılında Amerika Birleşik Devletleri'nde bulunan
Cetus şirketine bağlı olarak çalışan Henry A. Erlich,
Kary Mullis ve Randall K. Saiki tarafından geliştirilen
metod nükleik asitlerin canlı organizma içinde
bulunmadan, uygun koşullar altında çoğaltılmasına
dayanır. Hem araştırmada hem de klinik laboratuar
tanısındaki uygulama alanlarıyla büyük öneme sahip
olan PCR'ın geliştirilmesindeki çalışmaları nedeniyle,
K.Mullis, 1993 yılı Nobel Kimya Ödülünü
almaya hak kazanmıştır .Polimeraz Zincir
Reaksiyonu bir çeşit invitro (canlı organizma
dışındaki yapay ortam) klonlamadır. Her PCR, istenilen
sayıda tekrarlanabilen döngülerden oluşur.
Bir PCR döngüsü sırasıyla,deoksiribonükleikasidin
(DNA) iki zincirinin yüksek sıcaklıkta birbirinden ayrılması
("Denaturation"); sentetik oligonükleotidlerin
hedef DNA'ya bağlanması ("Annealing") ve zincirin
yeni çift zincirli DNA'lar oluşturacak
şekilde uzaması ("Extension")aşamalarından meydana
gelir.Bu aşamaların her biri farklı sıcaklıklarda
gerçekleştirilir (sırasıyla 94°C-98°C; 37°C-65°C; 72°C).
PCR tekniği, tek ve çift sarmallı DNA, ya
da RNA için kullanılabilir.
PCR ile bir hedef DNA parçasından milyonlarca çoğaltmak
mümkündür. Reaksiyon başlatılmadan önce istenen sayıda
döngünün tekrarlanması sağlanabilir. Yöntemin temeli,
çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki
baz dizilerine tamamlayıcı olan, 18-20 baz
uzunluğunda bir çift sentetik oligonükleotid primer
kullanılarak, bu iki primer ile sınırlandırılan bölgenin
enzimatik olarak sentezlenmesinedayanır. PCR'ın en
önemli özelliği çok az miktarda DNA ile çalışmaya
olanak sağlamasıdır. Bir PCR döngüsü için gerekli
olan beş ana madde vardır: DNA örneği, genelde
genomik DNA; çoğaltılacak bölgeyi sağdan
ve soldan çevreleyen bir çift sentetik primer;
deoksi-nükleotit-trifosfatlar (dNTP); yüksek ısıya
dayanıklı DNA polimeraz enzimi; uygun pH ve iyon
koşullarını (Mg+2) sağlayan tampon karışımı, genelde
MgCl2. PCR yöntemi kolay uygulanabilir olması
ve hızlı sonuç vermesi gibi avantajları nedeniyle,
birçok farklı alanda kullanılabilmektedir. Bu alanlar
şöyle özetlenebilir:
1) Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı,
2) Prenatal (doğum öncesi) tanıda,
3) Klinik örneklerde patojen(hastalık yapabilecek)
organizmaların saptanması,
4) Adli tıpta,
5) Onkogenesisin(kanser yapan hücrelerin oluşum evresi)
araştırılmasında,
6) "Probe"(sonda) oluşturulmasında; klonlamada; gen
tanımlaması araştırmalarında,
7) DNA dizi analizinde; büyük miktarda
DNA örneklerinin oluşturulmasında,
8) Bilinmeyen dizilerin tayininde,
9) Geçmiş DNA'nın incelenmesi ve evrimin
aydınlatılmasında,
10) "Restriction Fragment Length Polymorphism" (RFLP)
analizinde,
11) In vitro fertilization (canlı hücre dışında
gerçekleşen sperm yumurta birleşmesi) yapılan tek
hücrede, implantasyon(döl tutma) öncesi genetik testlerin
yapılmasında ve implantasyonun gerçekleştirilmesi ile
bebeğin normal doğumunun sağlanması sırasında,
12) DNA-Protein interaksiyonunun(etkileşiminin) araştırılmasında
("footprinting") kullanılabilir.

PCR'ın kullanıma geçmesiyle laboratuvar tanısında çok büyük bir hız
ve kesinlik kazanılmış, bir çok durumda radyoaktivite kullanımı gereksiz
hale gelmiştir.

Kaynak: YTÜ Moleküler Biyoloji ve Genetik Kulübü

------------------------------


Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), bir deoksiribo nükleik asit (DNA) zincirinin bilinen iki parçası arasında uzanan özel bir DNA bölümünün enzimatik olarak çoğaltıldığı in vitro bir teknik olarak her geçen gün yaygınlaşmaktadır. PCR metodu, teşhis, epidemiyolojik ve DNA miktarı belirleme çalışmaları gibi birçok amaçla kullanılmakta ve geliştirilmeye devam edilmektedir. PCR’ın kullanıldığı tüm alanlarda meydana gelen gelişmelerden, mikrobiyoloji alanı da önemli oranda payını alarak gelişmeye devam etmektedir. İnsan ve hayvan kaynaklı patojenik mikroorganizmalar için pek çok amaçla kullanılan PCR aynı zamanda günümüzde kullanılan birçok moleküler metodun temelini oluşturmaktadır. Reaksiyon her ne amaçla çalışılırsa çalışılsın, her gen bölgesi için, kullanılacak reagent ve PCR parametrelerinin optimizasyonunun yapılması gerekmektedir. Hatta yapı-lan optimizasyonun, PCR’ın gerçekleştirileceği farklı aletler ve laboratuvarlar arasında bile tekrar yapılması gerekebilmektedir.

Kaynak: Uludağ uni.

------------------------------


Pcr nedir?

Pcr, Polimeraze Chain Reaction kelimelerinin baş harflerinden oluşan bir kısaltmadır ve Türkçe'de Polimeraz Zincir Reaksiyonu anlamına gelmektedir [pcr]

Pcr ilk defa 1985 yılında Celera genomics calışanı Carry Mullis tarafından tanımlanmış ve günümüze kadar birçok defa geliştirilerek kullanılmaya devam edilmiştir.

Pcr; Laboratuvar ortamında spesifik dna dizilerinin primer denilen sentetik oligonükleotid diziler yardımıyla çoğaltılması işlemine denilmektedir.

Standart bir Pcr Protokolü yoktur. Bileşenler çoğaltılacak Dna bölgesinin özelliklerine göre değişir.

Pcr tekniği sayesinden genomun tamamı bilinmeden ve konak hücreye gerek kalmadan sadece istenilen Dna dizisinin bilinmesiyle, o Dna parçası in-vitro olarak milyarlarca kez kopyalanabilir.

Klasik Pcr nedir?

Hedef DNA dizisinin her iki ucuna özgü spesifik primerler kullanılarak termostabil DNA polimeraz yardımıyla uygulanan PCR çeşididir.

Pcr gerçekleşme aşamaları nelerdir?

1- Denatürasyon

2- Annealing(Bağlanma)

3- Elongasyon(uzama)

Multiplex Pcr nedir?

Klasik veya Real-time PCR’nin modifikasyonuyla iki veya daha fazla farklı PCR amplifikasyonunun aynı reaksiyonda gercekleştirilmesine dayanmaktadır.

Reverse Transcription Pcr nedir?

mRNA ve viral rna gibi RNA hedef dizilerinin amplifikasyonu amacıyla kullanılır.Bu PCR çeşidinde bir reverse transkriptaz enzimi ve DNA primeri kullanılır.

Nested Pcr nedir?

Komplex mikrobiyal popülasyonlara ait hedef dizilerin spesifik bir şekilde amplifikasyonu klasik PCR yöntemleriyle bazen mümkün olmayabilir.

Pcr'da gerekli olan reaktifler nelerdir?

1- Kalıp olarak kullanılacak DNA

2- İki tane tek iplikli sentetik DNA oligonükleotidi (forward ve reverse primer), PCR yapılmak istenen gen dizisini belirler,

3- Dört tip deoksiribonükleotid trifosfat (dNTPs),

4- Yüksek ısıda çalışabilecek bir DNA polimeraz (Taq DNA pol.)

Pcr hangi 3 temel döngünün tekrarından oluşmaktadır?

Denatürasyon; 94ºC’de çift iplikçikli DNA’nın iki tek iplikçiğe ayrılması,

Annealing (eşleşme); 50-60ºC’de primerlerin tek iplikçik halindeki kalıp DNA’ya spesifik olarak bağlanmaları,

Extension (sentez); 72ºC’de, primerlerle sınırlandırılmış olan bölgenin Taq pol. tarafından amplifikasyonu.

------------------------------

Kaynaklar ve ileri okuma

http://www.dorak.info/genetics/realtime.html

http://www.dorak.info/genetics/glosrt.html

http://www.microbiologybook.org/pcr/Real%20Time%20PCR%20Tutorial.pdf

http://genome.cshlp.org/content/6/10/986.short

http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20TR/bolum6.pdf

http://yunus.hacettepe.edu.tr/~mergen/sunu/s_pcr.pdf

http://vetdergi.kafkas.edu.tr/extdocs/8_1/71_76.pdf

http://194.27.141.99/dosya-depo/ders-notlari/handan-tuncel/1-MOLEKULER-BIYOFIZIK-LAB.pdf

http://vetkontrol.tarim.gov.tr/adana/Belgeler/dergi%202013/1.pdf


------------------------



Yorumlar

Henuz yorum eklenmedi ilk ekleyen siz olun .Yorum Ekle

Arşiv

Online Üyeler

    Online üye yok !

Bülten Kayıt

b